12. PRINCIPALELE METODE UTILIZATE PENTRU TRANSFERUL GENELOR DE
INTERES METODE INDIRECTE – TRANSFORMAREA MEDIATA
1. Transformarea mediată de bacterii: Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes
2. Transformarea mediată de virusuri
METODE DIRECTE
1. Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule
2.Transformarea protoplastelor
a.Microinjectarea
b.Electroporarea
c.Sonicarea3. Electroforeza4. Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu
12.1 TRANSFORMAREA MEDIATĂ DE AGROBACTERIUM
Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes realizeză ceea ce
adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să transfere în ţesutul
vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (“tumor inducing”) – în cazul
speciei A. tumefaciens – sau Ri (“root inducing”) – în cazul speciei A. rhizogenes, care se integrează în
genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului
(“crown gall disease”) iar A. rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”). In decursul
PROMOTOR INTRON Secventa codificatoare poly A signal
Constructia unei transgene
Gena de interes
Gene bacteriene
•antibiotic marker
•replication origin
Gena marker pentru
selectia plantei
Plasmid ADN
Construct
“intrerupator” Sinteza proteinei Semnal stop
20
coevoluţiei plantă – microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a
le exploata mai bine ca şi surse de energie. ADN –T se transmite după legile Mendeliene, ca genă
dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de transformare genetică are loc în natură fără
intervenţia omului.
Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau două copii de ADN-T, iar o parte
din una dintre aceste secvenţe a fost regăsită în genomul unor plante nemodificate genetic. Celulele
vegetale care poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conţine gene cu
efect oncogen. Deleţia acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul şi integrarea
ADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aşa numitele latură dreaptă şi
stângă constănd din o secvenţă alcătuită din 24 de nucleotide care se repetă, reprezintă situri de
recunoaştere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes
este posibil transferul acestora în celule vegetale ţintă, celule care nu mai dobândesc caracter tumoral
şi deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes – fie ele gene marker sau raportoare
sau gene cu importanţă economică – pot fi introduse în plante fie prin linkage cu regiunea ADN-T
dezarmată prin recombinare, obţinându-se un aşa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între
secvenţele repetate laterale într-un replicon independent, ceea ce se numeşte vector binar. Existenţa
mai multor regiuni T în celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală
ţintă cu eficienţă crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utiliza
secvenţe omoloage ADN vegetal ţintă care induc, cu frecvenţă relativ scăzută, recombinarea omologă
între ADN-T şi ADN vegetal.
Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacă
unele dintre acestea nu formează tumori. Deşi spectrul de gazde pentru această bacteriei este limitat la
plantele dicotiledonate s-au obţinut tulpini supervirulente, capabile să infecteze eficient şi celulele
plantelor monocotiledonate. S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor şi prin intermediul
acestui vector bacterian. Eficienţa transformării celulei vegetale de către A. tumefaciens, variază destul
de mult în funcţie de specie, genotip sau chiar de ţesutul ţintă. Este foarte important, totodată, ca
ţesutul supus transformării să fie totipotent şi deci să regenereze plante transformate genetic. De cele
mai multe ori, însă, dintr-un ţesut doar un număr limitat de celule sunt totipotente şi nu întodeauna
acestea sunt şi cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat
metode potrivite pentru transformarea eficientă mediată de A. tumefaciens. Ca ţesuturi ţintă pot fi
utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rădăcini, hipocotile, peţiol, cotiledoane sau
seminţe întregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate în
1983, succesele iniţiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model tutunul (Nicotiana
tabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia, bumbacul, orezul, ovăzul, sorgul, trestia de zahăr,
grâul şi multe altele. Eficienţa transformării variază foarte mult de la o specie la alta în funcţie de:
identificarea metodei optime de cultură a ţesutului ţintă, condiţiile de cultură a materialului sursă, sau
suşa bacteriană utilizată. Aceşti factori afectează şi numărul de copii de ADN-T care se integrează în
genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei
singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetările au vizat descifrarea mecanismelor implicate în
colonizarea ţesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al
virulenţei bacteriene .
Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de
tutun în anul 1977. Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri determină formarea
rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta gene de interes, dacă acestea
au fost integrate în ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etapă intermediară,
în procesul de transformare mediată de A. rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au
capacitatea de a se alungi şi ramifica. Astfel, prin cultura rădăcinilor firoase se pot obţine metaboliţi
secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creşterea şi dezvoltarea rădăcinilor. Acest
sistem experimental este foarte potrivit şi pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi
biochimice mai simple şi, deci, mai uşor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate uşor, folosind
un echipament simplu şi ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile
din punct de vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate cotranfera
ADN-T de pe plasmida Ri şi un vector “binar”, de obicei o plasmidă mai mică. Aceasta din
urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o genă care conferă rezistenţă la un antibiotic,
21
o genă raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipică şi o genă cu importanţă economică.
Avantajul acestui sistem este acela că cele două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea
rădăcinilor firoase, şi ADN-T de pe vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiţi în
plantele transformate şi deci, vor segrega independent în descendenţă. Un avantaj aparte al sistemului
de transformare Ri este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot
fi uşor identificate şi selectate prin prezenţa fenotipului de rădăcină firoasă. Sistemul de transformare
mediată de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de specii de plante (în jur de 200 încă în
1989), dar asemănător sistemului A. tumefaciens răspunsul optim variază în funcţie de specie, genotip
sau suşa bacteriană. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente
de tulpină de la plante tinere, fragmente de peţiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau tuberculii de
cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar, formând rădăcini firoase numai la una din
extremele explantului, rădăcini capabile să ignore forţa gravitaţională. Mai mult, există date
experimentale care sugerează efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulenţă,
12.3 TRANSFORMAREA MEDIATĂ DE VIRUSURI
Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor eforturi
experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deşi, în 1984 a fost posibil transferul unei gene de
rezistenţa la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN cercetările ulterioare au demonstrat că genomul
viral nu poate accepta şi transfera fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că
virusurile ARN pot genera ADN prin transcripţie inversă a generat speranţa că, mult mai numeroasele
virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au
întâmpinat alte dificultăţi. ADN viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principala
22
sursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizaţi
în experimentele de transformare genetică a plantelor.
METODE DIRECTE
12.4 METODA “BIOLISTICS” – împuşcarea directă a ADN în celule
Metoda biolistică (“biolistics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în ţesuturi
ţintă este o metodă de transformare genetică a plantelor foarte rapida. In dezvoltarea acestei tehnici sau
investit foarte mult efort şi bani iar rezultatele obţinute au fost pe măsura aşteptărilor.
Metoda constă în accelerarea unor particule foarte mici (1μm diametru) din tungsten, wolfram
sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în ţesuturi vegetale ţintă. Această tehnică are
numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate generală: este o metodă uşor de aplicat,
printr-o împuşcătură pot fi ţintite mai multe celule, celulele supravieţuiesc după împuşcare, genele
purtate de particule îşi păstrează activitatea biologică, particulele pot fi împuşcate în straturile
superficiale sau în profunzimea unui organ vegetal. Celulele ţintă pot fi foarte diferite: polen, celule în
suspensie, embrioni imaturi, celule din ţesuturi diferenţiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor
sale biolistica a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permiţând transformarea cu succes
a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul,
sorgul, trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicaţie aparte a fost utilizarea împuşcării de
microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea mediată
de Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuşit împuşcarea directă în ţesuturi vegetale a celulelor
bacteriene întregi
Niciun comentariu:
Trimiteți un comentariu