Biotehnologia calea catre viitor Part 6

12.5. UTILIZAREA PROTOPLASTELOR PENTRU TRANSFERUL DIRECT DE
ADNProtoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie a
totipotenţialităţii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate până astăzi numărul
plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibilă a crescut permanent, ajungând
actualmente la aproximativ 400 de specii de plante.
Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN şi selecţia
transformanţilor. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii ADN
străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acţionează ca un factor de stress care
induce reacţii de răspuns la rănire – reacţii presupuse a declanşa starea de competenţă atât de
importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamănă cu o
suspensie bacteriană avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaţii mari de celule
23
individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au în general origine
clonală provenind din celule individuale. Eficienţa selecţiei transformanţilor este deci maximă în cazul
protoplastelor deoarece se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor
multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza
diferite metode, şi anume: a. Microinjectarea – constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a
ADN direct în protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale
întregi sau a ţesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct de vedere
tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent şi constă în imobilizarea protoplastelor recipiente
de tutun într-un strat foarte subţire de mediu solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost
imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea şi monitorizarea prin fotografiere a
protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea.
b. Electroporarea – implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezenţa unor
pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută şi durată foarte scurtă, porii formaţi în
membrană permiţând intrarea ADN străin în citoplasmă . Electroporarea a devenit o metodă de rutină
pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar şi pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La
plante electroporarea protoplastelor se foloseşte eficient pentru transformarea permanentă la
numeroase specii de plante incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină
necesitatea utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condiţiile oponenţei
acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker. Avantajele
electroporării constau în eficienţa crescută a incorporării ADN străin, reproductibilitatea şi simplitatea
acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării o reprezintă capacitatea de regenerare a
protoplastelor, dar şi acest dezavantaj a fost depăşit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau
chiar ţesuturilor întregi
c. Sonicarea – permeabilizarea membranei protoplastelor în prezenţa ultrasunetelor s-a dovedit, de
asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost
aplicată şi celulelor sau ţesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară mai redusă comparativ cu
electroporarea
12.6 ALTE METODE DE TRANSFER DIRECT AL ADN ÎN CELULELE VEGETALE
Electroforeza Migrarea ADN printr-un ţesut vegetal ţintă a fost o altă idee interesantă pentru transferul
de gene şi a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacţi de orz.
Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“)
Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin această
tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună cu ADN şi fibre
de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereţii celulari permiţând ADN să pătrundă în
citoplasmă. Metoda a fost aplicată iniţial transformării embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit
eficientă şi în transformarea celulelor vegetale. Cercetările de microscopie electronică au relevat
penetrarea peretelui celular de către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafaţa fibrelor şi este
introdus odată cu acestea în celulă. Având proprietăţi fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură
de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică a fost raportată folosind această
tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun şi Agrostis alba. Transformarea stabilă a
fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb şi tutun. Datele obţinute au indicat
transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun
24
cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezintă avantajul de a fi foarte simplă
şi ieftină, dar datorită riscurilor potenţiale pentru sănătatea umană se caută materiale alternative,
eventual biodegradabile .

Alte metode cu aplicabilitate restrânsă de transformare a celulei vegetale sunt: îmbibarea ADN în
ţesuturi utilizând seminţe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic,
macroinjectarea ADN în ţesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular şi
plasmalema. Astfel de metode se află, actualmente, în diferite faze de experimentare. De un interes
deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesită faze de cultură in vitro. O astfel de
metodă, cu potenţial deosebit este transformarea grăuncioarelor de polen, dar deocamdată rezultatele în
acest domeniu sunt relativ modeste
12.7 SELECŢIA TRANSFORMANŢILOR
Selecţia este o parte importanţă a proceselor de transformare. În general, genele de interes sunt
co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uşurinţă a celulelor recipiente transformate.
Markerii de selecţie cei mai utilizaţi conferă rezistenţă la agenţi chimici, cum ar fi antibiotice şi
erbicide. Manozo-6 fosfat izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai recenţi markeri de selecţie. Enzima
este codificată de gena manA de la E.coli, care converteşte monoza-6P în frucozo-6P. Astfel,
transformanţii ce conţin manA pot creşte pe manoză ca sursă de carbon. Această selecţie este un mod
pozitiv al acţiunii de creştere a ţesuturilor transformante cu o rată care să-i permită acest lucru.
Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecţia transformanţilor de sfeclă (0,94%), porumb (50%)
şi grâu (25%) .
Genele de selecţie pot fi utilizaţe într-o primă generaţie şi eliminate mai târziu prin încrucişare
convenţională. O posibilitate este de a obţine două ADN-T separate; una cu gene de interes şi alta cu
markeri de selecţie, în aceeaşi sau două celule diferite de Agrobacterium. Cele două ADN-T sunt
inserate în situsuri ne-link-ate în genomul plantei gazdă, permiţând mai târziu segregarea genetică .
Transformarea optimă se caracterizează printr-o singură copie a transgenei care va segrega
mendelian cu o expresie uniformă de la o generaţie la alta. Transformanţii ideali pot fi identificaţi cu
dificultate, depinzând de materialul vegetal care va fi transformat şi de cantitatea şi complexitatea
transgenelor. O genă inserată este esenţial randomizată în genom, se observă o variabilitate de la o
plantă transgenică la alta, fenomen cunoscut sub numele de „variaţie cu efect de poziţie.
Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizată gena nptII, sau neo, genă izolată din transpozonul
Tn5 de la Escherichia coli K12. Această genă codifică neomicinfosfotransferaza – enzima implicată în
detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina, paramomicina sau
geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful,
Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul – ca să le amintim pe cele mai importante. Pentru
această genă ca agenţi de selecţie se utilizează cel mai mult kanamicina (50 – 100 mg/l) sau geneticina.
Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicină, în acest caz
geneticina dând rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat că la unele specii kanamicina poate
interfera cu procesele de organogeneză, afectând eficienţa regenerării plantelor transformate.
O altă genă marker mult utilizată este gena hpt sau hph, genă izolată tot de la bacteria E. coli
codificând enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Această enzimă detoxifică antibioticul
higromicină B, antibiotic faţă de care majoritatea ţesuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea,
această genă marker a fost utilizată pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul,
Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este îndeosebi foarte potrivită ca
agent de selecţie pentru cereale, folosindu-se în concentraţii de 25-200 mg/l. Secvenţa codantă a genei
a fost, de asemenea, modificată pentru o expresie mai bună în celula vegtală.Dintre genele care conferă
rezistenţă la erbicide cel mai mult a fost utilizată gena bar, izolată de la bacteria Streptomyces
hygroscopicus şi gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificând enzima
fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid de
selecţie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca:
tutunul, rapiţa, porumbul, orezul, grâul şi altele. O altă genă marker este gena dhfr pentru enzima
25
dihidrofolatreductază (DHFR), izolată tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR conferă
rezistenţa la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la
concentraţii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferată la specii cum ar fi:
tutunul, petunia şi grâul.
Genele raportoare, spre deosebire de markerii de selecţie nu conferă celulelor rezistenţă faţă de un
anumit compus. Ele codifică proteine care pot fi detectate direct sau catalizează reacţii specifice ai
căror produşi pot fi detectaţi prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de
transcripţie cis sau trans, în condiţiile transformării tranziente sau permanente, precum şi
monitorizarea şi optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare
sunt:¨ gena gus (uidA) – codifică β-glucuronidaza (GUS) şi a fost izolată de la E. coli K12
(Jefferson şi colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizată la plante. Există pentru această
hidrolază compuşi substat pentru evidenţierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau
histochimice – la nivelul ţesuturilor rezultând un compus de culoare albastră uşor de evidenţiat. La pHul
utilizat pentru determinarea GUS nu există activitate β-glucuronidazică detectabilă în nici un ţesut
vegetal. Toate metodele de determinare se aplică însă, numai celulelor fixate, nonviabile.¨ gena
raportoare luc pentru enzima luciferază foloseşte un sistem substrat-enzimă care produce
bioluminescenţă. Gena luc a fost izolată de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus
pyralis, fiind exprimată în plante (Ow şi colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasă din
ţesuturi iar activitatea ei poate fi determinată în prezenţa luciferinei. Dar, există şi o metodă de
determinare non-letală şi neinvazivă direct în ţesuturile şi organele plantelor transformate, pentru
măsurarea bioluminescenţei fiind necesar un luminometru.
gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (GFP) – reprezintă cea mei nouă genă raportoare
şi totodată cea mai spectaculoasă şi avantajoasă. Gena a fost izolată de la o meduză, Aequarea victoria,
fiind transferată la câteva specii de plante (Chalfie şi colab., 1994). GFP prezintă o serie de avantaje şi
anume: nu necesită un substrat, proteina se evidenţiază în ţesuturi intacte in vitro şi in vivo, prin
excitarea în UV, proteina poate fi fuzionată cu alte proteine permiţând monitorizarea traficului proteic
şi a metabolismului (vezi Rakosy-Tican şi colab., 1999; 2000).¨ gena cat izolată de la E. coli,
codifică enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizată ca genă
raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenţioasă bazându-se pe monitorizarea acetilării
cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produşii fiind
separaţi prin cromatografie în strat subţire (TLC) şi măsuraţi prin densitometrie sau prin scintilaţie.
Uneori poate exista activitate CAT şi în unele ţesuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce
afectează eficienţa acestui sistem.¨ antocianii sunt pigmenţi roşii sau purpurii care se acumulează
în vacuole în unele ţesuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlată de gene structurale şi
reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate şi clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene
raportoare în ţesuturile şi organele unor genotipuri care conţin gene structurale dar nu sintetizează
antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezintă o serie de avantaje: nu necesită un substrat, se
exprimă doar în celulele viabile şi metabolic active, sunt uşor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat
genele pentru factorii de transcripţie R şi C1 de la porumb (Schrott, 1995).genele care conferă
rezistenţă la streptomicină şi/sau spectinomicină – au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare
prin efectul de etiolare pe care îl au, prin inactivarea cloroplastelor